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新型比色-荧光双通道探针NBD-M,用于硫化氢的检测

http://www.b2b.hc360.com 中国金属加工网 信息来源:Author发布时间:2020年05月25日浏览:2354

  摘要以7-硝基苯并呋咱(NBD)为荧光团,经一步有机合成,高产率制备比色荧光双通道探针,用于检测环境和体内硫化氢(H2S)的含量。以无水Na2S为H2S供体,考察了探针的选择性、灵敏性等性能。结果表明,探针荧光强度与H2S浓度在5~50μmol/L浓度范围内呈良好的线性关系,检出限为0.125μmol/L,同时反应溶液由无色变为紫色。采用MTT法测试探针的细胞毒性,结果表明,在探针浓度低于50μmol/L条件下,细胞存活率高于90%。激光扫描共聚焦显微成像结果表明,探针可靶向细胞溶酶体,可对溶酶体内H2S进行成像研究。

  1引言

  硫化氢(H2S)是一种无色且具有臭鸡蛋气味的气体,一般由工业中含硫物质非完全燃烧产生,被认为是一种有毒环境污染物。近年的研究发现,H2S是生命体内一种重要的内源性气体信号分子,参与多种重要的生理过程[1~4],H2S浓度异常与许多疾病有关,如阿尔茨海默氏症、唐氏综合症、糖尿病和肝硬化等[5,6]。但是,其在体内的潜在分子机制尚不明确[7,8]。因此,基于H2S在环境和生命体内的重要作用,开发灵敏有效的分析方法具有重要的意义[9]。

  传统的H2S检测方法包括吸收光谱法、电化学法、气相色谱法和硫沉淀法等[10~13],而光学探针法发展迅速。其中,比色法可不借助昂贵的仪器设备,直接对目标物裸眼分析;荧光探针法选择性好、灵敏度高,可对生物样本(细胞、组织和活体等)内目标物进行实时荧光成像研究。基于H2S的化学性质(还原性、亲核性等),研究者发展了多种反应型H2S荧光探针[14~16],包括还原型(芳香叠氮/硝基/羟胺还原为胺基)[17~20]、亲核型(亲核取代[21,22]、亲核加成/双亲核加成[23,24])、形成CuS沉淀型[25]等。近年来,虽然已报道了大量H2S荧光探针,但是开发兼具制备简便、选择性好、灵敏度高等优点,并能够实现比色和熒光双通道检测H2S的优良的探针分子,用于检测环境和生物样品中的H2S,仍然是当前的研究热点。

  2013年,本研究组[26]和Pluth研究组[27]分别发现7-硝基苯并呋咱(NBD)胺可与H2S发生亲核取代反应,其产物NBD-SH可用于比色检测H2S。基于此,利用多种光物理扰动原理,构建了系列选择性检测H2S的比色荧光双通道探针[28~30]。进一步利用NBD优秀的荧光性质,本研究组[31]和易龙研究组[32]分别构建了以7-羟基香豆素连NBD为骨架结构的比例计量型H2S荧光探针,实现了细胞线粒体和溶酶体内H2S的比例成像研究。

  考虑到上述探针分子需要多步有机合成进行制备,本研究以NBD为荧光团,吗啉为溶酶体靶向基团,经一步有机反应,设计合成了新型比色荧光双通道H2S探针NBD-M。此探针本身具有荧光,与H2S反应后的产物NBD-SH在水溶液中荧光较弱,因此,可产生由开到关的荧光变化;同时,利用产物NBD-SH的颜色变化可比色检测溶液中H2S。考察了探针的溶酶体靶向的功能,并测试了探针检测细胞溶酶体内H2S的能力。

  2实验部分

  2.1仪器与试剂

  Brucker 600核磁共振仪(美国Brucker公司,TMS为内标);Varian 7.0 T FTICR-MS质谱仪、UV-3600型分光光度计(美国Agilent公司);F-7000型荧光光谱仪(日本日立公司);PHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂);ZF-7型三用紫外分析仪、X-4显微熔点仪(上海精密仪器仪表有限公司)。4-氯-7-硝基苯并呋咱和吗啉(阿拉丁试剂有限公司);其它试剂均购于天津光复试剂公司。所用试剂均为市售分析纯,实验用水为二次蒸馏水。

  2.2探针NBD-M的合成

  将200 mg(1.00 mmol)NBD-Cl和91 mg(1.05 mmol)吗啉溶解于10 mL二氯甲烷,向其中加入209μL(1.50 mmol)三乙胺,室温反应1 h后,加入10 mL水,萃取,有机相加入无水Na2SO4干燥,蒸除溶剂,所得粗品用硅胶柱分离(二氯甲烷-甲醇,100∶1,V/V)得淡红色固体,产率90%。熔点:147.2~148.5℃。1H NMR(DMSO-d6,600 MHz),δ(ppm):8.51(d,J=9.0 Hz,1H),6.68(d,J=9.0 Hz,1H),4.13~4.12(m,4H),3.85~3.83(m,4H)。13C NMR(DMSO-d6,151 MHz),δ(ppm):14539,14475,14473,13621,12136,10342,6567,4947。MS(ESI+)calcd for[M+H+]341.1,found 341.2。探针NBD-M的合成路线见下式。

  2.3光谱测试

  配制2 mmol/L探针的DMSO溶液,在室温下、磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH 7.4,0.02 mol/L)中进行光谱测试,探针浓度为10μmol/L,激发波长为490 nm,激发和发射狭缝宽度均为5 nm。选择性测试所需各种潜在干扰物质均溶于纯PBS,测试浓度为200μmol/L。

  2.4细胞成像

  细胞培养实验方法和条件参见电子版文后支持信息。HeLa细胞接种于35 mm细胞成像专用玻底培养皿,成像细胞密度为2×104。加入NBD-M(10μmol/L)和商品化溶酶体定位探针Lyso-Tracker Red(20 nmol/L)共孵育30 min,用PBS洗涤3次后,进行共定位成像研究。探针NBD-M荧光通道激发波长为488 nm,发射波长范围500~550 nm;Lyso-Tracker Red荧光通道激发波长为546 nm,波长采集范围590~640 nm。

  3结果与讨论

  3.1探针的光谱性质

  探针的荧光性质是探针荧光检测和成像的基础。考察了不同溶剂对探针紫外吸收和荧光发射光谱的影响。随着溶剂极性增加,探针的最大紫外和荧光发射均发生红移(电子版文后支持信息表S1)。如图1所示,在PBS中,探针的最大紫外吸收和荧光发射分别为496和576 nm,斯托克斯位移高达80 nm,在实际应用中可有效避免激发光对检测光谱信号的干扰。

image.png

  3.2探针对H2S的识别性能研究

  在PBS(0.02 mol/L,pH 7.4)溶液中,探针的最大紫外吸收峰强度在探针浓度0~4.0×104 mol/L范围内线性关系良好(r=0.9993),表明探针具有良好的水溶性(电子版文后支持信息图S2)。如图2所示,将探针溶液(10μmol/L)和新配H2S溶液(200μmol/L)混合,30 min后反应体系的荧光信号基本稳定。计算所得探针与H2S反应的假一级反应动力学常数(kobs)约为2.1×103 s1,二级反应动力学常数(k2)为10.5 L/(moL·s),与其它NBD基亲核取代型H2S荧光探针的常数的数量级相当[18,26],表明探针可作为一种快速检测H2S的荧光关闭型探针。

image.png

  Na+、Ca2+、Fe2+、Ba2+、Mg2+、Cu2+、F、Cl、Br、I、NO3、SO24、NO2、HClO、Vc、KO2、SO23、H2O2、Hcy、Cys、GSH、H2S),测试其荧光发射光谱(λex=490 nm)。H2S可使探针的荧光显著降低,而其它物质不会明显改变探针的荧光强度,表明探针NBD-M对H2S的荧光响应具有较高的选择性。

  为了评估探针对H2S的检测灵敏性,进行了荧光滴定实验。向探针溶液(10μmol/L)中依次加入不同浓度(0~100μmol/L)的新配H2S溶液,孵育15 min,探针与576 nm處的最大发射峰荧光强度逐渐增强。在5~50μmol/L浓度范围内,H2S的浓度与探针的荧光强度呈现良好的线性关系,其线性方程为y=266.13-3.43x(r=0.9942),检出限为0.125μmol/L(S/N=3),与已报道文献相当[26]。上述结果表明,探针NBD-M可定量检测H2S的浓度,具有较高的灵敏度。

  探针与H2S反应后,探针最大紫外吸收峰发生明显红移。文献报道,探针与H2S反应后,产物NBD-SH具有明显的颜色[26,27]。向探针溶液(10μmol/L)中加入0、10、20、30、40、50、75和100μmol/L的新配H2S溶液,室温孵育5 min后,可明显观察到溶液由淡黄色变为紫色,并且随着H2S加入量的增加,溶液紫色逐渐加深。基于探针溶液的颜色变化与不同H2S浓度之间的相关性,可简便地半定量检测水样中20μmol/L H2S。因此,探针NBD-M可实现对H2S的比色和荧光双通道检测。

  3.3探针对H2S的识别机制研究

  为了研究探针与H2S的识别机制,向探针溶液中加入等摩尔数的H2S,测试了探针与H2S反应前后的核磁共振氢谱。探针1位和2位芳香氢的化学位移分别为6.67和8.51 ppm,与H2S反应后,此位置芳香氢的化学位移分别7.00 ppm和8.07 ppm移动到7.42 ppm。结合探针与H2S反应的紫外吸收光谱和溶液颜色变化,推测探针与H2S发生亲核取代反应。

  3.4探针对细胞内H2S荧光成像研究

  荧光关闭型荧光探针已被报道用于内源性H2S的成像研究[33~35]。利用四唑盐(MTT)比色法,对探针的细胞毒性进行评价,发现探针在浓度低于50μmol/L时,细胞存活率高于90%,可用于细胞实验研究。

  一些小分子胺类基团(如吗啉、N,N-二甲基胺等)本身具有碱性,含有此类结构的荧光探针能够选择性地积累在弱酸性细胞器,实现溶酶体定位功能。利用商品化溶酶体定位探针(Lyso-Tracker Red)进行细胞器共定位成像研究。向HeLa细胞加入含有20 nmol/L共定位探针Lyso-Tracker Red和10μmol/L探针NBD-M的培养基,共孵育15 min,可观察到两个探针光谱重叠良好,共定位皮尔森相关系数为0.93[36],表明探针具有良好的溶酶体定位能力。

  利用探针对细胞内H2S进行荧光成像研究。HeLa细胞在含有10μmol/L探针的培养基中孵育15 min,可观察到明显的黄色荧光;先孵育100μmol/L H2S 30 min,再孵育探针15 min,黄色荧光明显降低;先孵育200 mol/L H2S 30 min,再孵育探针15 min,黄色荧光基本完全消失。荧光成像实验表明,探针NBD-M能够用于HeLa细胞溶酶体内H2S的成像研究。

  4结论

  合成了一种新型比色-荧光双通道探针NBD-M,能够高选择性和高灵敏识别H2S。探针与H2S反应后,溶液颜色由无色逐渐变为紫色,能够裸眼检测含20μmol/L H2S的水样,具有一定的应用前景。此探针能够靶向HeLa细胞溶酶体,可用于细胞内H2S的成像研究。


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